pcr引物设计详细步骤

pcr引物设计详细步骤

我们想要设计引物，首先我们要找到DNA序列的保守区，同时应该要预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构，下面小编就来讲讲pcr引物设计详细步骤？

我们在制作引物时最好在模板cDNA的保守区内设计，DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。

引物长度一般在15~30碱基之间，引物长度常用的是18~27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃，GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。

引物3’端要避开密码子的第3位，如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

引物3′端不能选择A，最好选择T，引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成。

1. 引物最好在模板cDNA的保守区内设计。

2. 引物长度一般在15~30碱基之间。

3. 引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。